Page 78 - 畜牧兽医与现代农业技术研究

Research on Animal Husbandry and Veterinary Medicine and Modern Agricultural Technology
畜牧兽医与现代农业技术研究

AFLP）、实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、环介导等温
扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、多重连接依赖性探针扩增
（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、高分辨率熔解曲线（high
resolution melting，HRM）以及 DNA 测序。

上述方法有些已成功用于动物疫病实验室的检测，但是有的灵敏度仍然受到
自身技术限制，尤其是在低丰度样本及复杂性样品检测中。近些年，数字 PCR
（digital PCR，dPCR）已被用于核酸检测，例如转基因成分分析、动植物产品检
测等，特别是在肿瘤学诊断中其显示出了巨大潜力。尽管 dPCR 在动物疫病实验

室检测领域的应用相对不及医学领域的快速发展，但该方法可能在将来诊断和控
制动物疫病中发挥重要作用，未来将需要更精确灵敏的诊断手段来支持流行地区
的动物疫病控制，以及在动物疫病非流行地区所进行的流行病学监测。
（一）原理

dPCR 能够对样品中存在的目标核酸进行绝对定量，避免了 qPCR 的不足。
dPCR，首先通过预处理，将样品稀释和分配到多个独立分区中，通过创建“油包
水”乳液（微滴式数字 PCR）、使用具有微通道的芯片（微流控芯片数字
PCR）或微流体芯片（微滴芯片式数字 PCR）实现分区，每个分区包含很少或者

没有目标序列；然后，每个分区充当单独的 PCR 微反应器，PCR 扩增后，每个
分区被量化为具有或不具有靶序列，即为阳性（1）或阴性（0）结果；最后荧光
检测包含扩增靶序列的分区，根据泊松分布原理以及阳性分区与总数的比值确定
样品中待检靶分子的浓度或拷贝数。因为样品分配可有效地将目标序列集中在分

隔的微反应器中减少了模板竞争，能够检测稀有突变以及痕量核酸；此外，它还
允许 PCR 扩增反应对样品中存在的抑制剂具有更高的耐受性。根据反应单元形
成方式的不同，数字 PCR 主要可分为微滴式数字 PCR、微流控芯片数字 PCR 和
微滴芯片式数字 PCR 等。
1. 微滴式数字 PCR

微滴式数字 PCR（droplet digital PCR，ddPCR）基于乳液 PCR（emulsion PCR）
技术，通过油水不相容的原理，油形成油膜将水包裹在其中，形成一个个微滴作
为反应室。微滴发生器可将样品生成数万乃至百万个纳升甚至皮升级别的单个油

包水微滴，每个微滴都成为一个独立的反应器，随后微滴完成 PCR 扩增，最后
微滴分析仪对微滴逐个进行荧光检测。相比阴性微滴，包含至少一个目标核酸分

66