Page 278 - 新编动物防疫检疫手册

本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥 3 min，不能过于干燥，以
免 RNA 不溶。

⑺ 加入 11 μL DEPC 水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA， 2000r/min 离心

5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置-70℃
冰箱。

3.3 检测

⑴ 扩增试剂准备

在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的荧光 RT-PCR 反应液、Taq

酶，在室温下融化后，2000r/min 离心 5s。设所需荧光 RT-PCR 检测总数为 n，其
中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反应体系配制如下：

RT-PCR 反应液 15μL，Taq 酶 0.25μL。根据测试样品的数量计算好各试剂的使

用量，加入到适当体积中，向其中加入 0.25×n 颗 RT-PCR 反转录酶颗粒，充分
混合均匀，向每个荧光 RT-PCR 管中各分装 15μL，转移至样本处理区。

⑵ 加样

在样本处理区进行。在各设定的荧光 RT-PCR 管中分别加入上述样本处理中

制备的 RNA 溶液各 10μL，盖紧管盖，500r/min 离心 30s。

⑶ 荧光 RT-PCR 检测
在检测区进行。将本标准中离心后的 PCR 管放入荧光 RT-PCR 检测仪内，记

录样本摆放顺序。

循环条件设置：第一阶段，反转录 42℃ /30 min；第二阶段，预变性 92℃ /3
min； 第 三 阶 段，92 ℃ /10s，45 ℃ /30s，72 ℃ /1 min，5 个 循 环； 第 四 阶 段，

92℃ /10s，60℃ /30s，40 个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。

试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和 Ct 值判定结果。

4 结果判定

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