Page 154 - 医学检验技术发展与创新
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医学检验技术发展与创新
Development and Innovation of Medical Laboratory Technology
（三）基于测序的分子诊断技术
高通量测序，又称下一代测序，包括第二代边合成边测序、第三代单分子
测序和第四代纳米孔测序技术。高通量测序具有准确、灵敏及适合大样品等优势，
但也存在成本不低和对操作人员水平要求高等问题。高通量测序使得研究人员可
对结核病、HIV 和流感病毒等进行早期分型和进化分析，对耐药基因和机制及药
物靶标发现等进行研究，以追踪或预防流行性疾病的大爆发，因此未来极有可能
取代各基于杂交和扩增的分子诊断技术。Stoesser 通过对阴沟肠杆菌 NDM-1 质粒
高通量测序，有力挑战了阴沟肠杆菌主要为散发感染这一观点。Snitkin 对耐碳烯
青霉素的肺炎克雷白杆菌分型，可迅速明确传染源。
第一代基因测序是指 Gilbert 化学降解法和 Sanger 测序。Sanger 应用较为广泛，
其测序读长可达 1000bp，准确度高和适合少样本，代表仪器是 ABI3700 分析仪，
当时迅速推动了基因测序自动化。但该法存在以下不足：费时费力、测序成本高
和自动化程度低，难以满足大规模测序要求；对未明确目的基因或目的基因较多
的大样本病例筛选较为困难，且仅可在扩增后逐段测序；大量数据处理需要交给
专业公司处理，这反而限制了该技术的市场价值。
第二代测序技术已发展为成熟和高通量的测序技术，但该技术中的大量
洗脱过程使测序成本仍十分昂贵，容易出现测序错误；读长较短，普遍不超过
400bp，这是其难以广泛应用的最大缺陷；大量数据分析过程耗时耗力。代表测
序平台是 Roche454、HiSeq2000 和 5500XL 等，其中 Roche454 已于 2016 年开始
被淘汰焦磷酸测序仪。
第三代测序技术已实现了单分子测序，该技术是在第二代测序基础上，改
进了测序时间、增加了读长、降低了成本且可直接检测甲基化序列等，但由于仪
器成本和数据分析成本的增加，目前仍不是最有效的测序技术。代表性测序平台
是 HeliScope 遗传分析系统和 Pacific Biosciences 公司单分子实时（SMRT）测序技
术，后者相对较为成熟。
第四代基因测序技术，又称纳米孔测序技术。处于纳米孔中的分子会对通
过该孔的电流产生影响。核酸分子碱基序列不同，对通过的电流影响也会不同，
通过捕捉该信号差异从而判断核酸序列。纳米孔测序实现了单分子检测和电子信
号检测的结合，摆脱了荧光标记、洗脱和 PCR 扩增过程。该技术具有读长高达
150kb、高通量和数据分析简便等优势。Roche、Illumina 和 Lifetech 公司已着力
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