Page 121 - 医学检验技术发展与创新

第四章 分子诊断临床应用

特异性寡核苷酸（ASO）点印迹杂交方法。患者 DNA 样本含有野生型或突变型
mtDNA，将其PCR 产物与相应的核酸探针杂交，野生型的mtDNA 只结合正常探针，
同质突变型的 mtDNA 只结合突变探针，而异质突变型的 mtDNA 将与野生型和突
变型 ASO 探针杂交。该方法灵敏度高，能同时分析多个位点突变。对于低百分

比的突变异质性也可以检测。但不能进行定量检测。
对于大片段缺失可采用 Southern 杂交进行检测，基本原理是经限制性内切
酶酶切后的 DNA 片段，琼脂糖凝胶电泳及变性后，转移至固相支持物上，与
相应的标记探针进行杂交。使用 Southern 杂交时需注意检测样本的选择。由于

mtDNA 缺失的线粒体病患者，其不同组织中含有的突变型 mtDNA 比例不同，在
肌肉和脑等组织中突变型 mtDNA 比例较高，但在血液中可能检测不到。
对于一些尚不清楚的点突变可采用单链构象多态性（SSCP)、变性高效液相
层析（dHPLC)、变性梯度凝胶电泳（DDGE）及 DNA 测序等进行检测。

SSCP 是基于单链 DNA 构象的差别来检测突变。相同长度的单链 DNA 由于
碱基序列不同，形成不同的空间构象，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为不
同的迁移率，区分野生型 DNA 和突变型 DNA。SSCP 操作简单，能够快速、有效
地检测各种类型的突变，如点突变、缺失和重复等，但如果突变导致空间构象变

化微小，迁移率相差无几，会出现假阴性，进而影响检测的灵敏度。
dHPLC 方法可以筛查未知单核苷酸多态性和突变，具有高通量、自动化、
特异性高、快速等优点，是分析异质性突变首选的检测方法。该方法主要通过
PCR 扩增得到相同长度的 DNA 片段，突变型 DNA 片段和野生型 DNA 片段只有

一个位点的差异，退火后可形成同源双链和异源双链，两者在层析柱中的移动速
度不同，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同
源双链，故先被洗脱下来，野生型和突变型得以区分，由此达到检测基因突变的
目的。目前也有许多研究将 DDGE 变性高效液相层析技术用于检测 mtDNA 突变。

因不受其他筛选方法敏感性和特异性的限制，DNA 测序技术是进行突变分
析最直接和最准确的方法，已成为检测基因突变的金标准。DNA 测序技术主要
包括第一代测序技术（Sanger 测序）、第二代测序技术（NGS）和第三代测序技
术。近年来，NGS 被广泛用于研究 mtDNA 缺陷，主要适用于检测 mtDNA 大片段

缺失和异质率，已成为 mtDNA 遗传分析的首选方法。NGS 主要包括全基因组测
序（WGS）和全外显子测序（WES)，其中 WGS 是对生物体整个基因组序列进行

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