Page 267 - 新编动物防疫检疫手册
P. 267
2.4 PCR
根据扩增目的不同，选择不同的上 / 下游引物，M-229U/M-229L 是型特异性
引物，用于扩增禽流感病毒的 M 基因片段；H5-380U/H5-380L、H7-501U/H7-
501L、H9-732U/H9-732L 分别特异性扩增 H5、H7、H9 亚型血凝素基因片段；
N1-358U/N1-358L、N2-377U/N2-377L 分别特异性扩增 N1、N2 亚型神经氨酸酶
基因片段。
PCR 为 50μL 体系，包括：
双蒸灭菌水 37.5μL
反转录产物 4μL
上游引物 0.5μL
下游引物 0.5μL
10×PCR Buffer 5μL
2.5mmol dNTPs 2μL
Taq 酶 0.5μL
首先加入双蒸灭菌水，然后按顺序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。
全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到 PCR 管底。在每个 PCR 管中加
入 1 滴液体石蜡（约 20μL）。循环参数为 95℃ 5min，94℃ 45s，52℃ 45s，72℃
45s，循环 30 次，72℃延伸 6min 结束。设立阳性对照和阴性对照。
2.5 电泳
2.5.1 制备 1.0% 琼脂糖凝胶板，见附录 A.4。
2.5.2 取 5 μL PCR 产物与 0.5μL 加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样
孔中。
2.5.3 加入分子量标准。
2.5.4 盖好电泳仪，插好电极，5V/cm 电压电泳，30 ～ 40min。
257
257
