Page 266 - 新编动物防疫检疫手册

2.2.2.1 向组织或细胞中加入适量的变性液，匀浆。
2.2.2.2 将混合物移至一管中，按每毫升变性液中立即加入 0.1mL 乙酸钠，

1mL 酚，0.2ml 氯仿 - 异戊醇。加入每种组分后，盖上管盖，倒置混匀。

2.2.2.3 将匀浆剧烈振荡 10s。冰浴 15min 使核蛋白质复合体彻底裂解。
2.2.2.4 12000r/min，4℃离心 20min，将上层含 RNA 的水相移入一新管中。为

了降低被处于水相和有机相分界处的 DNA 污染的可能性，不要吸取水相的最下层。

2.2.2.5 加入等体积的异丙醇，充分混匀液体，并在 -20℃沉淀 RNA 1h 或更长

时间。

2.2.2.6 4℃ 12000 r/min 离心 10 min，弃上清，用 75% 的乙醇洗涤沉淀，离心，
用吸头彻底吸弃上清，自然条件下干燥沉淀，溶于适量 DEPC 处理的水中。-20℃

贮存，备用。

2.2.3 也可选择市售商品化 RNA 提取试剂盒，完成 RNA 的提取。
2.3 反转录

2.3.1 取 5μL RNA，加 1μL 反转录引物，70℃作用 5min。

2.3.2 冰浴 2min。

2.3.3 继续加入：

5× 反转录反应缓冲液 4μL
0.1M DTT 2μL

2.5mmol dNTPs 2μL

M-MLV 反转录酶 0.5μL
RNA 酶抑制剂 0.5μL

DEPC 水 11μL

37℃水浴1h，合成cDNA链。取出后可直接进行PCR，或者放于-20℃保存备用。

试验中同时设立阳性和阴性对照。

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