Page 410 - 新编动物防疫检疫手册
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品 200μL，充分混匀，静置 5 分钟。同时设阳性和阴性对照管，每份样品换一个
吸头。
2.2 加入 200μL 氯仿，充分混匀，静置 5 分钟，4℃、12000g 离心 15 分钟。
2.3 取上清约 500μL（注意不要吸出中间层）移至新离心管中，加等量异丙醇，
颠倒混匀，室温静置 10 分钟，4℃、12000g 离心 10 分钟。
2.4 小心弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入 1000μL 75% 乙醇，颠
倒洗涤，4℃、12000g 离心 10 分钟。
2.5 小心弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；4000 g 离心 10 分钟，将管壁
上残余液体甩到管底部，小心吸干上清，吸头不要碰到有沉淀的一面，每份样品
换一个吸头，室温干燥。
2.6 加入 10μL DEPC 水和 10U RNasin，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，
4000 g 离心 10 分钟，尽快进行试验。长期保存应置 -70℃以下。
3 cDNA 合成
取 200μL PCR 专用管，连同阳性对照管和阴性对照管，每管加 10μL RNA
和 50 pM 下 游 引 物 P2 （5’-CACAG（CT）CC（AG）AA（TC）CC（AG）
AAGTCATC -3’），按反转录试剂盒说明书进行。
4 PCR
4.1 取 200μLPCR 专用管，连同阳性对照管和阴性对照管，每管加上述
10μL cDNA 和适量水，95℃预变性 5 分钟。
4.2 每管加入 10 倍稀释缓冲液 5μL，上游引物 P1（5’-TC（GA）（AT）
CAACCAA（TC）GAGATAGGG-3’） 和 下 游 引 物 P2 各 50pM，10 mol/L dNTP
2μL，Taq 酶 2.5U，补水至 50μL。
4.3 置 PCR 仪，循环条件为 95° C 50sec，58° C 60sec，72° C 35sec，共 40
个循环，72° C 延伸 5 分钟。
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